Нашу кожу населяют многочисленные микроорганизмы, составляющие её микрофлору. Наш организм живёт в постоянном балансе с бактериями, заселяющими поверхность эпидермиса, а также поры, протоки сальных и потовых желёз. Особенно многочисленны микробы на ладонях и пальцах рук, поэтому поддержание чистоты и гигиены является необходимым условием здоровой кожи. И поэтому нам необходимо выбрать правильные дезинфицирующие средства.
На современном рынке представлен широкий ассортимент моющих и дезинфицирующих средств, поставщики обещают надёжную защиту от патогенных бактерий при их использовании. Главная проблема заключается в выборе дезинфицирующих средств.
Объект: объектом нашего исследования являются микроорганизмы.
Предмет: дезинфицирующие средства (туалетное мыло).
Проблема: защищают ли современные дезинфицирующие средства от болезнетворных микроорганизмов.
Цель: определение чувствительности типичной для кожи человека микрофлоры к данным средствам.
Задачи:
- Изучить всю необходимую литературу по данной теме.
- Рассмотреть проблему с теоретической точки зрения, выдвинуть теории.
- Рассмотреть опыты, доказывающие или опровергающие теорию.
- Рассмотреть результаты, сделать общие выводы.
Гипотеза: на первом этапе нашего исследования установить – справляется ли туалетное мыло со своей задачей. Для этого необходимо выяснить:
- какие микроорганизмы населяют поверхность подушечек пальцев человека и чувствительны ли они к туалетному мылу;
- погибают ли после мытья рук микроорганизмы, населяющие поверхность подушечек пальцев.
Основная часть.
Микроорганизмы
Для начала, было бы не лишним вспомнить про бактерии и их классификацию.
Микрооргани́змы, (микро́бы) — собирательное название группы живых организмов, которые слишком малы для того, чтобы быть видимыми невооружённым глазом . В состав микроорганизмов входят как безъядерные - прокариоты: бактерии, археи, так и эукариоты: некоторые грибы и протисты. Большинство микроорганизмов состоят из одной клетки.
1.1 Классификация и морфология микроорганизмов
Микробы - это мельчайшие, преимущественно одноклеточные живые организмы, видимые только в микроскоп. Размер микроорганизмов измеряется в микрометрах — мкм (1/1000 мм) и нанометрах — нм (1/1000 мкм). Микробы характеризуются огромным разнообразием видов, отличающихся строением, свойствами, способностью существовать в различных условиях среды. Они могут быть одноклеточными, многоклеточными и неклеточными.
Бактерии — преимущественно одноклеточные микроорганизмы размером от десятых долей микрометра. Различают три основные формы бактерий — шаровидные (кокки), палочковидные (бациллы и др.), извитые (вибрионы, спирохеты, спириллы).
Шаровидные бактерии (кокки) имеют обычно форму шара, но могут быть немного овальной или бобовидной формы. Кокки могут располагаться поодиночке (микрококки); попарно (диплококки); в виде цепочек (стрептококки) или виноградных гроздьев (стафилококки), пакетом (сарцины).
Палочковидные бактерии самые распространенные. Палочки могут быть одиночными, соединяться попарно (диплобактерии) или в цепочки (стрептобактерии). К палочковидным относятся кишечная палочка, возбудители сальмонеллеза, дизентерии, брюшного тифа, туберкулеза и др.
Извитые бактерии могут быть в виде запятой — вибрионы, с несколькими завитками — спириллы, в виде тонкой извитой палочки — спирохеты. К вибрионам относится возбудитель холеры.
Бактериальная клетка имеет клеточную стенку (оболочку), часто покрытую слизью. Нередко слизь образует капсулу. Содержимое клетки (цитоплазму) отделяет от оболочки клеточная мембрана. Цитоплазма представляет собой прозрачную белковую массу, находящуюся в коллоидном состоянии. В цитоплазме находятся рибосомы, ядерный аппарат с молекулами ДНК, различные включения запасных питательных веществ (гликогена, жира и др.).
Микоплазмы - бактерии, лишенные клеточной стенки, нуждающиеся для своего развития в ростовых факторах, содержащихся в дрожжах.
Некоторые бактерии могут двигаться. Движение осуществляется с помощью жгутиков — тонких нитей разной длины, совершающих вращательные движения. Жгутики могут быть в виде одиночной длинной нити или в виде пучка, могут располагаться по всей поверхности бактерии. Жгутики есть у многих палочковидных бактерий и почти у всех изогнутых бактерий. Шаровидные бактерии, как правило, не имеют жгутиков, они неподвижны. Размножаются бактерии делением на две части. Скорость деления может быть очень высокой (каждые 15-20 мин), при этом количество бактерий быстро возрастает. Такое быстрое деление наблюдается на пищевых продуктах и других субстратах, богатых питательными веществами.
Вирусы — особая группа микроорганизмов, не имеющих клеточного строения. Размеры вирусов измеряются нанометрами (8-150 нм), поэтому их можно увидеть только с помощью электронного микроскопа. Некоторые вирусы состоят только из белка и одной из нуклеиновых кислот (ДНК или РНК). Вирусы вызывают такие распространенные болезни человека, как грипп, вирусный гепатит, корь, а также болезни животных — ящур, чуму животных и многие другие.
Из этого вытекает, что некоторые микробы представляют большую угрозу чем нам кажется. Я думаю , дальнейшее изучение микроорганизмов может дать нам больше опыта и знаний, в борьбе с опасными бактериями.
1.2 Воздействие микроорганизмов на наш организм
Хочу отметить, что причиной возникновения многих болезней является попадание в организм живых микроорганизмов: бактерий, вирусов или простейших. Сегодня доказано, что возникновение некоторых сердечно-сосудистых заболеваний, язвенной болезни желудка также связано с микробами.
Я считаю, что на сегодняшний день полезно знать общие сведения о микробах. Микроорганизмы занимают особое место в нашей жизни. От их жизнедеятельности зависит активность всего живого. Разнообразие микроорганизмов, населяющих организм человека, невероятно большое. Представьте , только в полости рта и кишечном тракте обитает более 400 видов различных бактерий, которые участвуют в пищеварении, выработке иммунитета, синтезе необходимых витаминов и многих других процессах.
Исследования свидетельствуют, что на сегодняшний день изучено лишь 5-10% всех микробов. Человечеству еще предстоит открыть огромное число новых представителей микробного мира.
Достижения в микробиологии за последние годы показали, что бактерии для своего выживания, как и люди, широко используют преимущества, которые дает коллективное поведение.
1.3 Механизм действия дезинфицирующих веществ на микроорганизмы
Процессы, которые возникают и протекают при воздействии химических дезинфицирующих веществ на микробную клетку, называются механизмом действия дезинфицирующих веществ.
Состояние обеззараживания или обеспложивания не наступает немедленно. Процесс гибели микробов происходит постепенно, со скоростью, зависящей от многих факторов, в первую очередь от того, что среди микробов даже одного и того же вила есть особи, очень устойчивые и не сразу поддающиеся воздействию дезинфицирующего средства, и особи, почти мгновенно погибающие при тех же условиях.
Основное значение в дезинфекционном процессе имеют: 1) взаимодействие между дезинфицирующим веществом и микробной клеткой, а также с окружающей ее средой (органическими и неорганическими веществами); 2) проникновение (диффузия) его через оболочку внутрь клетки; 3) реакция дезинфицирующего вещества с составными частями клетки.
Эти явления сами по себе очень сложны и зависят, с одной стороны, от природы и химического строения дезинфицирующего вещества и его физического состояния (твердое, жидкое, газообразное), с другой — от проницаемости оболочки микробной клетки и связанных с этим явлений осмоса, диффузии и других физико-химических явлений. Степень проницаемости оболочки в свою очередь зависит от ее структуры и от наличия в ней тех или иных соединений, препятствующих проникновению в клетку посторонних веществ.
Применяя современные методы лабораторного исследования, можно изучать результаты воздействия дезинфектантов на микробные клетки. Изучению этих вопросов во многом способствует также применение электронномикроскопических методов исследования, с помощью которых можно наблюдать повреждающее действие на клетку дезинфектантов.
Следует отметить, что многие из вопросов механизма действия дезинфицирующих средств недостаточно изучены и неодинаково объясняются исследователями, но многие важные закономерности установлены и ими руководствуются в практике дезинфекции.
Как показывают наблюдения, дезинфицирующие вещества обладают наибольшей способностью к проникновению внутрь клетки в том случае, когда они находятся в растворе. Напротив, в твердом виде они почти полностью лишены свойства проникать через оболочку микробной клетки.
Для проникновения газообразных дезинфицирующих веществ через оболочку микробной клетки также требуется небольшое количество жидкости, в которой могло бы раствориться то или иное количество этих веществ. Проникшее внутрь клетки в достаточном количестве дезинфицирующее вещество вступает в соединение с различными частями клетки, выполняющими жизненно важные для микробов функции (функции дыхания, обмена веществ, размножения и др.). Поэтому о механизме действия дезинфицирующих веществ на микробную клетку судят не только по гибели их, но и по тому, как нарушаются и изменяются в клетке процессы ее ферментативной деятельности (дыхание, питание, способности роста и др.) (В. Н. Гладкова).
Если действие дезинфицирующего вещества на клетку слабое, то жизненные функции клетки, в том числе и функции размножения, лишь замирают — происходит мнимая смерть клетки. При изменении условий существования клетки к лучшему (например, при нейтрализации или удалении яда) жизненные функции снова начинают проявляться и могут восстановиться до нормы. Такое обратимое действие дезинфицирующего вещества на микробную клетку, которое ведет не к полной ее гибели, а лишь к замиранию жизнедеятельности, называют бактериостатическим, а само вещество — бактериостатиком.
Если дезинфицирующее вещество при действии на микробную клетку вызывает в ней необратимые изменения, ведущие к окончательной ее гибели, то такое действие называют бактерицидным, а вещество — бактерицидом.
2.Методика
2.1 Техника приготовления мазка
Для работы необходимо иметь чистые и обезжиренные предметные и покровные стекла. Новые стекла кипятят 15-20 мин в 2-5% растворе соды или мыльной воде, споласкивают водой и помещают в слабую хлороводородную кислоту, затем тщательно промывают водой. Стекла, бывшие в употреблении и загрязненные красителями или иммерсионным маслом, можно обработать двумя способами: 1) погрузить на 2 ч в концентрированную серную кислоту или хромовую смесь, а затем тщательно промыть; 2) кипятить 30-40 мин в 5% растворе соды или щелочи. Необработанные стекла можно обезжирить, натерев их мылом, а затем очистить от него сухой тканью. Хранят стекла в сосудах с притертыми пробками в смеси Никифорова (равные объемы спирта и эфира) или в 96% спирте. Из растворов стекла извлекают пинцетом. Материал для исследования наносят на предметное стекло бактериальной петлей, иглой или пастеровской пипеткой. Чаще всего применяют бактериальную петлю (рис. 7), сделанную из платиновой или нихромовой нити длиной 5-6 см. Петлю закрепляют в петледержателе или впаивают в стеклянную палочку. Конец проволоки сгибают в виде кольца размером 1×1,5 или 2×3 мкм. Перед приготовлением мазка рабочую часть петли прожигают в пламени горелки в вертикальном положении: сначала саму петлю, а затем металлический стержень. Эту манипуляцию проводят и после окончания посева.
Приготовление мазка из культуры, выращенной на жидкой питательной среде. Обезжиренное предметное стекло прожигают в пламени горелки и охлаждают. На предметное стекло, помещенное на подставку (чашку Петри, штатив), наносят культуру. Пробирку с культурой держат большим и указательным пальцами левой руки. Петлю держат в правой руке. Не выпуская петли, мизинцем правой руки прижимают пробку к ладони и осторожно вынимают ее из пробирки. Движения должны быть плавными и спокойными. Горло пробирки обжигают в пламени горелки. Вводят петлю в пробирку. Охлаждают петлю о стенку пробирки и затем погружают ее в культуру. Вынимают петлю, не касаясь ею стенок пробирки. Закрывают пробку, предварительно проведя ее через пламя горелки. Ставят пробирку в штатив. Петлей наносят культуру на предметное стекло, круговыми движениями равномерно распределяя ее. Затем петлю прожигают в пламени горелки. Мазок оставляют для высыхания.
Приготовление мазка из культуры, выращенной на плотной питательной среде. На подготовленное предметное стекло наносят пастеровской пипеткой или петлей каплю изотонического раствора натрия хлорида (0,9%). Культуру осторожно снимают петлей с агара в пробирке или чашке Петри и эмульгируют в капле на стекле. Приготовленный мазок должен быть равномерным и не густым. При его высыхании на предметном стекле остается слабый налет.
2.2 Высушивание мазка
Мазок высушивают на воздухе при комнатной температуре. В случае необходимости его можно высушить около пламени горелки, держа стекло в горизонтальном положении за края большим и указательным пальцами мазком вверх.
2.3 Фиксация мазка
Мазки фиксируют после полного высыхания с целью: 1) закрепить микроорганизмы на стекле; 2) обезвредить материал; 3) убитые микроорганизмы лучше воспринимают окраску. Фиксированный мазок называется препаратом.
Способы фиксации.
- Физический - в пламени горелки: стекло берут пинцетом или большим и указательным пальцами и троекратно проводят через верхнюю часть пламени горелки в течение 6 с.
- Химический - в жидкости: клеточные элементы в мазках из крови и мазках-отпечатках при действии высоких температур разрушаются, поэтому их обрабатывают одной из фиксирующих жидкостей: а) метиловым спиртом- 5 мин; б) этиловым спиртом - 10 мин; в) смесью Никифорова - 10-15 мин; г) ацетоном - 5 мин; д) парами кислоты и формалина - несколько секунд.
2.4 Окраска препаратов
После фиксации приступают к окраске препарата.
Окраску препаратов производят на специально оборудованном столе, покрытом линолеумом, пластиком, стеклом и т. д. На столе необходимы сосуд с дистиллированной водой; подставка из двух трубочек или палочек, соединенных резиновыми трубками с обеих сторон (для размещения препаратов); пинцеты, цилиндры, пипетки, фильтровальная бумага, набор красителей, емкость для их слива. Стол для окраски должен находиться рядом с водопроводным краном.
Отношение микроорганизмов к красителям называется их тинкториальными свойствами. В микробиологии широко используют анилиновые красители. Большинство микроорганизмов лучше воспринимает основные красители.
Наиболее употребительны следующие красители: красные (фуксин основной, фуксин кислый, конго красный, нейтральный красный); синие (метиленовый и толуидиновый); фиолетовые (генциановый, метиловый, кристаллический); коричнево-желтые (везувин, хризоидин); зеленые (бриллиантовый, малахитовый).
Все красители выпускают в виде аморфных или кристаллических порошков. Из них готовят насыщенные спиртовые и феноловые растворы, а затем для работы используют водно-спиртовые или водно-феноловые растворы красителей. Если при окраске используют концентрированные растворы красителей, то препарат предварительно накрывают фильтровальной бумагой, на которую наносят краситель. При этом кусочки красителя остаются на бумаге.
3.Практическая часть
3.1 Определение эффективности бытового моющего средства.
Материалы:
- Бактериологическая среда (Лурия-Бертани, LB) (1% триптон; 0.5% дрожжевой экстракт; 0.5% NaCI)
- Посуда для бактериологических исследований: чашки Петри пластиковые стерильные, петли бактериальные, спиртовки, колба на 250 мл, банка с винтовой пробкой для автоклавирования на 250 мл.
- Моющее средство: бытовое мыло (состав: натриевая соль пальмового масла, вода, глицерин, отдушка).
Методика:
1)Приготовить питательную среду: взвесить 2 г триптона; 19 г дрожжевого экстракта; 19 г NaCI. Растворить в 200ml дистиллированной воды.
2)Проверить рН, при необходимости довести рН до 7,0 NaOH.
3)Автоклавировать при 121º C 30 мин.
4)Разлить после охлаждения среду по чашкам Петри:
- Приоткрыть крышку чашки Петри левой рукой, а правой взять колбу с охлажденной средой и налить среду на дно чашки Петри, заполняя всю ее поверхность и наполняя чашки от 1/3 до половины Закройте чашку и переходите к следующей.
- Оставить чашки Петри на столе до полного застывания среды, затем поставить в термостат на 15-20 минут для подсушивания.
- Если нужно хранить чашки долго, их необходимо сложить стопкой, склеить клейкой лентой и сложить в пластиковый пакет, в котором они были, чтобы предотвратить их высыхание. Пакет запечатать клеткой лентой, перевернуть, чтобы на поверхность среды не капал конденсат, и хранить в холодильнике.
5) Подписать чашки
6) Прислонить большой палец руки к поверхности питательной среды в чашке, выдержать 30 с.
7) Вымыть руки с приготовленным моющим средством и, не касаясь каких либо поверхностей, приложить к питательной среде в другой чашке, выдержав 30 с.
8) Перевернуть чашки дном вверх, инкубировать в термостате при 37 С, 24 часа.
3.2 Оценка результатов
После инкубации открыть чашки и посчитать кол-во выросших колоний, оценить их размеры, форму, цвет.
При описании колоний микроорганизмов отмечают следующие морфологические признаки:
- размер колоний – их диаметр в мм (если колонии не превышают 1 мм, их называют точечными);
- форма колоний – округлая, неправильная, мицелевидная, амебовидная, складчатая, сложная и т.д.;
- цвет колонии – белый, желтый, розовый и способность выделять пигмент в среду;
- поверхность колоний – гладкая, складчатая, с радиальной или концентрической исчерченностью, шероховатая, бугристая и др.;
- оптические свойства – прозрачная, полупрозрачная, непрозрачная, блестящая, матовая и т.д.;
- край колоний – ровный, извилистый, зубчатый, лопастной, волнистый, неправильный, реснитчатый, ветвистый;
- консистенция колоний – маслянистая, тестообразная, вязкая, пленчатая.
После описания переходят к микроскопии:
1.Подписываем предметные стекла номерами наших колоний.
2.Используя петлю, переносим колонию на предметное стекло. Добавляем каплю воды, размешиваем клетки и накрываем покровным стеклом, предварительно добавив каплю метиленового синего.
3.Положим петлю в емкость для сброса отработанного материала.
9)Рассматриваем стекла под микроскопом с увеличением 400х. Пронаблюдали за бактерий, их формой, соединены ли клетки в цепочки.
В чашке с отпечатком пальца, проведённом до обработки рук моющем средством, выросшее за 24 часа число колоний = 228 шт. Поскольку каждая колония является поколением одной бактериальной клетки, а площадь отпечатка примерно равна 3 см2 можно предположить, что на 1 см2 поверхности кожи пальцев испытуемого имелось около 76 бактерий. Во второй же чашке (после мытья рук) выросло 28 бактерий, что более чем в 8 раз меньше, что позволяет оценить эффективность используемого моющего средства. Микроскопия бактерий и оценка колоний показала наличие микроорганизмов 2х родов: Bacillus и Streptococcus.
Выводы
Проведенные исследования позволяют сделать следующие выводы:
Поверхность подушечек пальцев человека населяют в основном бактерии двух родов: бациллы и стрептококки.
Наше туалетное мыло на 100% не уничтожает бактерии, а всего лишь 70% - 80% бактерий.
Это доказывает, что большинство микроорганизмов являются чувствительными к туалетному мыло и погибают, поэтому мыло справляется со своей задачей.
Но для того, чтобы добиться более эффективной защиты от болезнетворных микробов и выяснить по какой причине выжившие бактерии остались нечувствительными к мылу, человеку есть ещё над чем работать.
Следующим этапом нашего исследования будет: установить как действуют другие дезинфицирующие средства, представленные на современном рынке бытовой химии, на микроорганизмы, населяющие поверхность подушечек пальцев.
Библиография
1. Википедия - свободная энциклопедия – URL: https://ru.wikipedia.org;
2. Черкес Ф. К., Богоявленская Л. Б., Бельская Н. А. Микробиология : учебник / ; под ред. Ф. К. Черкеса. М. : Медицина, 1987. 512 с
3. GenBank – URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank.
4. Human Microbiome Project – URL: http://hmpdacc.org.
5. Life Technologies Corporation – URL: http://www.lifetechnologies.com.
6. Ling Huang at. al., Lan Ma, Kun Fan, Yang Li, Le Xie, Wenying Xia, Bing Gu and Genyan Liu Necrotizing pneumonia and empyema caused by Neisseria flavescens infection // Journal of Thoracic Disease. – 2014. – № 6(5). – P. 553–557.
7. Mahapatra A., Mahapatra S., Mahapatra A. Escherichia fergusonii: an emerging pathogen in South Orissa // Indian journal of medical microbiology. – 2005. – Vol. 23. – № 3. – P. 204.
8. Morris S.K., Nag S., Suh K.N., Evans G.A. Recurrent chronic ambulatory peritoneal dialysis-associated infection due to Rothia dentocariosa // Canadian Journal of Infectious Diseases & Medical Microbiology. – 2004. – № 15. – P.171–173.
9. Медицинский советник-URL: http://wwind.dp.ua/
10. Микробиология-URL: http://www.grandars.ru/
11. Лечебно-диагностический комплекс "Центр ДНК"-URL: http://dnkcentr.ru/
12.Фрида Карловна Черкес, Лина Борисовна Богоявленская, Наталья Александровна Бельская;Микробиология//URL-http://biologylib.ru/Основы классификации и морфология микроорганизмов, 1986.